Теги
Подписаться

«Мы дозорные на Стене, потому что ночь темна и полна ужасов». Интервью с вирусологом

«Мы дозорные на Стене, потому что ночь темна и полна ужасов». Интервью с вирусологом
Полина Полещук
Полина Полещук
редактор

В Петербурге отсеквенировали первый «российский» геном коронавируса SARS-CoV-2. Это в том числе даст ученым из России и зарубежья больше возможностей для создания вакцины и лекарств, которые могут помочь справиться с пандемией. Вместе с заведующим лабораторией вирусологии НИИ гриппа имени А. А. Смородинцева Минздрава России Андреем Комиссаровым мы разбирались в том, как распространение вируса влияет на его мутации, почему результаты секвенирования важны для всех, отчего рынки диких животных ― это опасно и какой вирус вдохновил создателей фильма «Заражение».

Зачем в принципе секвенировать «российский» геном коронавируса SARS-CoV-2? Отдельные люди скажут, мол, его ж давно уже расшифровали, и вообще, что это за «российский» геном. (Секвенированием называется определение последовательности нуклеиновых кислот, которое выполняется на специальном оборудовании — секвенаторах. — Прим. ред.)

Это нужно, чтобы понимать, как распространяется вирус, откуда он попал к нам, какие в его геноме есть мутации. Анализируя последовательности, можно проследить, как он «вышел» из Уханя и какие замены в геноме произошли за это время. Анализируя геномы по образцам из разных стран, можно практически в режиме реального времени следить за тем, как вирус меняется. Это дает возможность понимать изменчивость нового коронавируса, чтобы создавать вакцину. Уже сейчас мы можем практически быть уверенными, что он не такой изменчивый, как грипп, а более консервативный. Чтобы все это знать, каждой стране нужно проводить секвенирование вирусов из образцов, которые получают от больных из разных регионов. 

К сожалению, Россия долгое время являлась «белым пятном» для ученых всего мира, которые исследуют проблему. У нас в самом конце января ― начале февраля были зарегистрированы первые случаи заболевания, но отсутствовали генетические данные. И теперь они есть.

Вы анализировали образец, полученный от заболевшего человека? Откуда его привезли?

Мы как национальный центр по гриппу ведем надзор за гриппом и ОРВИ. Из разных больниц города нам привозят мазки из носоглотки людей с симптомами ОРВИ. Мы умеем тестировать на SARS-CoV-2, хотя пока не уполномочены делать это официально. Однако Всемирная организация здравоохранения обеспечила нас тест-системой, благодаря которой мы проверяем людей с ОРВИ на новый коронавирус тоже. Ведь сейчас эпидемия в России находится в той стадии, когда люди заражаются, даже если никуда не ездили. Поэтому есть смысл проверять всех людей с признаками ОРВИ на новый вирус.

Мы проверили набор мазков от людей: из каждой больницы в день приходит от 20 до 100 мазков. На днях пришло около 20 и один из них дал положительный результат. Это был мазок от петербургского пациента.

Мы готовились к этому моменту, и у нас было все, чтобы провести секвенирование, ведь мы постоянно секвенируем сотни образцов с вирусом гриппа. Нам было интересно: мы заранее заказали реагенты и находились в полной готовности. Два дня, две ночи работы ― и результат готов.

А пациент-то знает, что его мазок стал героем?

Думаю, что вряд ли. (Улыбается.)

А когда к вам пришел образец? 

15 марта.

И вы его быстро прогнали через весь цикл секвенирования?

Да.

Как назовете?

hCoV-19/Russia/StPetersburg-3524/2020. Нам важно, чтобы в названии был Петербург.

А как вообще устроен процесс секвенирования?

Пришла пробирочка с тремя миллилитрами жидкости, а в ней ― аппликаторы, похожие на ершики, которые довольно глубоко засовывали человеку в носоглотку. На них остаются клетки эпителия. Неприятная процедура, сразу текут слезы, но необходимая. Ершики находятся в этих трех миллилитрах жидкости, потому что она представляет собой транспортную среду, в которой биологический материал сохраняется. Сухим его принести нельзя.

Из этих трех миллилитров мы берем некоторое количество, выделяем РНК на специальных колонках. Ставим полимеразную цепную реакцию (ПЦР): если вирус есть, видим флуоресцентный сигнал. Если его нет ― сигнала на приборе не видим. 

Итак, вирус есть. Здорово! Дальше нам нужно еще раз подтвердить это. Для этого используется еще одна ПЦР тест-система. Важно не допустить ошибку. Теперь можно переходить к секвенированию. В пробирке у нас есть некоторое очень маленькое количество вирусной РНК, которую можно секвенировать. Существуют разные методы секвенирования, но так или иначе у вас должно быть много того, что вы хотите секвенировать. А в образце вирусной РНК очень мало, а человеческой очень много. Поэтому вам нужно провести амплификацию вирусного генома ― увеличить количество, то есть размножить то, что есть. Для коронавируса есть система реагентов, которая позволяет разбить геном на маленькие кусочки и размножить их. На выходе у вас в пробирке будет много-много маленьких участков коронавирусного генома ― и очень мало человеческого. 

Снимок экрана 2020-03-24 в 21.33.33.png

На фото нанопоровый секвенатор MinION от Oxford Nanopore
Набор фрагментов генома, готовых к секвенированию, называется библиотекой. Эту библиотеку после подготовки наносим на прибор ― нанопоровый секвенатор MinION от Oxford Nanopore. Он похож на большую флешку, подключенную к компьютеру. Там есть специальные поры, их много. Через каждую пору проходит фрагмент нуклеиновой кислоты из той библиотеки, что мы туда нанесли. И каждый раз, когда через пору проходит фрагмент, меняются электрические свойства этой поры. Генерируется электрический сигнал, который зависит от того, какая буква проходит: A, G, T или C. Соответственно, сигнал отправляется на компьютер и он его обрабатывает. И мы можем секвенировать отдельные молекулы, которые проходят через поры. Прибор работает два часа, а данных много ― они обрабатываются двое суток. 

Есть такое понятие, как «глубина секвенирования». Поясню на примере: вы можете прочесть слово (допустим, AGTC) в тексте один раз. Но если вы смотрите на текст один раз, вы легко можете не заметить опечатку, если вдруг она там есть. И поэтому одно и то же слово нужно прочитать много раз: берем ту же последовательность из AGTC. Если вы прочли ее один раз, то глубина равна единице. Если вы прочли два раза, протащив одну и ту же молекулу через разные поры секвенатора, то глубина будет 2x. Большую часть генома мы «прочли» с глубиной больше 100x. А некоторые участки были прочитаны с глубиной 28 000x. В среднем это 900 прочитываний. Хорошая глубина прочтения ― залог качества итоговой последовательности генома.

На самом деле, чем равномернее читаются участки, тем лучше. Просто нам нужно еще поработать над протоколом, ведь пока что геном прочитан неравноценно: некоторые участки были перечитаны много раз, а другие ― довольно мало. Поэтому сейчас мы заказали дополнительные реагенты, чтобы это исправить. 

В прибор можно поместить один образец, а можно 96. Но производительность прибора одна. Если вы засунули туда один образец, вы прочитаете его суперглубоко. Если одновременно 96 разных ― то каждый вы прочитаете в 96 раз менее глубоко. Соответственно, если у вас неравноценная глубина и одни куски «лучше» других, то какие-то кусочки можно совсем потерять. Поэтому протокол нужно оптимизировать, чтобы можно было секвенировать много вирусов за раз. А дальше начался процесс опубликования последовательности в базах данных ― пока что ее проверяют перед публикацией. 

Эта работа нужна, чтобы понимать, как меняются вирусы и как они циркулируют в разных странах. Это дает глобальную картину и понимание его эволюции и перемещений.

Сколько может стоить один запуск секвенатора?

Это около 150–200 тысяч рублей. Это довольно недорогой способ, иные доходят до 800 тысяч рублей за запуск. Главное, чтобы для запуска были реагенты, ― мы зависим от закупок и поставок. Их очень сложно производить, потому что для каждой технологии свои реагенты. В научном мире, где есть международное разделение труда, не нужно пытаться воспроизвести технологию с нуля, если уже имеется то, что требуется, и необходимого качества. Не стоит изобретать велосипед: есть какие-то вещи, в которых мы сильнее, есть те, в которых мы слабее, ― и это совершенно нормально.

А много где уже отсеквенировали «свои» местные геномы нового коронавируса?

Да, конечно. Секвенированный нами вирусный геном примерно 923-й по счету.

Получается, что в каждой стране нужно проводить свое секвенирование?

Да.

Но ведь Россия ― огромная страна. У нас множество регионов, у которых есть свои особенности и условия: климат, окружающая среда, образ жизни, население и еще множество факторов. 

Покрытие территории страны генетическим надзором за вирусом очень важно. К сожалению, даже в случае довольно хорошо изученного вируса гриппа у нас покрытие страны молекулярно-генетическим надзором по сравнению с американцами, например, довольно небольшое. То есть они делают десятки тысяч секвенирований сезонного гриппа, а мы делаем сотни. Да, у них больше численность населения, но у нас она тоже не маленькая, как и территория. 

Я рассчитываю, что в исследовании нового коронавируса к нам присоединится как можно больше групп российских ученых. Мы открыты, готовы делать это, если у нас будут образцы и реагенты. И мы заинтересованы в этом, потому что это большая мировая работа. Все, кто может секвенировать, должны секвенировать, чтобы было больше сиквенсов из России. Мы готовы делать, главное, нас от образцов не отлучать. (Улыбается.)

Получается, что поучаствовать в этом прекрасном деле может любой регион, отправивший вам образцы пациентов, у которых подтвердилось COVID-19. 

Верно: с гриппом так и работает. Образцы присылают в лаборатории, в которых умеют это делать. Чтобы так же было и с коронавирусом, нужна только политическая воля.

Хорошо. Вот у нас есть российско-питерский геном. Когда мы сможем понять, чем он отличается от своих китайских, европейских, американских и других родственников?

Эта последовательность будет доступна всем ученым: они включат ее в свой анализ, и теперь уже вместе с ней будет выходить ежедневное обновление о том, какие вирусы отсеквенированы, чем они отличаются от своих собратьев и к какой группе они относятся. Даже если мы ничего делать не будем, мировое научное сообщество все равно проанализирует наши данные. Это важно, ведь нас больше 140 миллионов.

Что нам нужно узнать о новом коронавирусе?

Прежде всего нужно узнать, какие его участки наиболее подтверждены изменениям. Ведь если мы хотим вакцину, то делать ее, основываясь на высоковариабельном участке, бессмысленно. Тогда нужно выбрать консервативный участок генома ― но и тут все не гладко, ведь он должен отвечать ряду требований. Чем лучше мы понимаем, как вирус мутирует, чем больше таких данных, тем легче принимать решения для дизайна вакцины.

Конечно, сейчас в США делают первые попытки создания вакцины, основываясь на тех данных, что у них есть. Можно опираться и на данные о других коронавирусах: например, предполагать, что SARS-CoV-2 будет меняться схоже с его собратьями по семейству.

Снимок экрана 2020-03-24 в 21.36.43.png

Сколько времени нам нужно, чтобы понять, как сильно отличаются особенности вируса в каждой стране?

Для этого нужны дни ― не так уж много времени. Пока что те задачи, что есть у нас, мы решаем сами. Но вычислительных мощностей все же не хватает. Мы хотели бы делать некоторые задачи быстрее ― филогеографический анализ или поиск новых вирусов. Они требуют на порядок более мощных компьютеров, чем у нас есть. Но для генома нового коронавируса того, что есть, было достаточно.

Последовательности публикуются для всех желающих, это открытые данные. Их может анализировать кто угодно. В том числе и мы.

Насколько вирус изменился с тех пор, как отправился в путешествие по миру из Уханя? Сильно?

Нет. Он изменяется, но далеко не так сильно, как грипп. 

А можно будет на основе существующих данных делать вывод о характере вируса: грубо говоря, в каком регионе он повел себя агрессивнее, а где «пощадил» больше людей?

Для этого недостаточно иметь только генетические данные. К ним нужно прибавить качественную эпидемиологическую информацию и клинические данные. Например, с гриппом сейчас обстоит так: у нас есть сиквенс плюс история болезни пациента с тем, как он себя чувствовал и какие у него были проявления. Эта работа ведется в рамках международного проекта «Сеть госпитального надзора за гриппом» (GIHSN). По коронавирусу такого пока нет, но, думаю, что клинические данные позже подтянут ко всем остальным.

А что для вас лично значит вся эта работа? Почему она так интересна вам?

Это наша жизнь. Мы практически живем на работе. Невозможно заставить людей делать хорошо свою работу, если она им неинтересна. Конечно, у нас есть цель ― снизить глобальный ущерб от ОРВИ для людей и колоссальные экономические потери, предотвратить человеческие трагедии. Чем лучше мы понимаем эволюцию гриппа и ОРВИ, тем более рациональные решения мы можем принимать. И тем легче создавать вакцины, препараты и снижать ущерб. Первое, что нужно знать, ― что циркулирует вокруг нас, какой возбудитель. И мы здесь ― глаза и уши. Потому что мы ― надзор. Дальше наши данные используют специалисты, которые делают вакцины и препараты, ведь их нельзя делать вслепую. И нас возбуждает то, что мы на переднем крае.

Это как в «Игре Престолов»...

Да, мы дозорные на Стене, точно. Потому что ночь темна и полна ужасов. (Смеется.)

Но все же почему это важно лично для вас?

Как только что-то начинает получаться, невозможно просто взять и уйти с работы: ты делаешь до конца без остановки. После записи подкаста о коронавирусе я пошел не домой, а на работу. Мы запустили секвенатор и сидели до часа ночи в лаборатории ― ждали первых результатов. 

Борьба с вирусами ― это война, только врага ты не видишь. Ты первым получаешь информацию, как он устроен. В один из прошлых эпидемических сезонов мы в моем старом кабинете втыкали флажки в большую настенную карту России, исходя из того, откуда мы получили гриппозные образцы, например из какого-то далекого города в Якутии или из глухого поселка в средней полосе России. Сейчас мы уже не втыкаем флажки в бумажную карту, а отмечаем все на интерактивной карте на компьютере.

Наша задача ― понимать, что и где происходит в нашей стране, ведь она огромная и на самом деле малоизученная. Это огромное поле для деятельности. Это так круто: наша страна заслуживает того, чтобы из каждого региона было много данных. Да, у нас есть проблемы денежные и логистические, но мы стараемся их решать. 

команда.jpg

Команда Андрея Комиссарова

Мы ведем статистику сроков от сбора образцов до отправки, анализируем транзитное время и то, когда и в каком состоянии образец пришел. Это огромная менеджерская работа, которая может показаться скучной, но когда ты сводишь это в единый отчет, видно, как можно подкрутить систему, чтобы она работала лучше. И чтобы та же вакцина от гриппа, которую нужно делать новую каждый год, работала лучше. Поэтому в осенне-зимний период и в новогодние праздники мы работаем круглыми сутками, чтобы успеть к вакцинному совещанию. (Это совещание в штаб-квартире ВОЗ в Женеве, на котором ученые всего мира выбирают состав вакцины от гриппа на следующий год. ― Прим. ред.) И чем больше сиквенсов мы сделаем, тем больше вакцина будет соответствовать тому, что есть в России, и, следовательно, лучше защищать людей. Потому что если мы сложим ручки и сделаем один сиквенс, то она будет основана на чужих, иностранных данных, но в меньшей степени сможет защищать нас. Как это можно обозвать? Патриотизмом, если хотите. 

Дайте нам больше финансовых возможностей, и мы покроем всю Россию генетическим надзором, сделаем сиквенсы из каждого города и будем знать, как распространяются инфекции здесь. Когда это будет big data, тогда будет новый уровень анализа и понимания того, что происходит. Ведь иначе есть абсурдные ситуации, когда мы не знаем ничего о том, что происходит в некоторых регионах.

Возможно ли предотвратить такие ситуации, когда отчасти из-за человеческой безответственности и от незнания мы получаем от животных внезапно агрессивные вирусы?

Рынки живых животных ― это дикость, когда у тебя в одной клетке или в клетках рядом одновременно сидят летучие мыши, панголины, куры, циветты, змеи. Все они окажутся убитыми, чтобы их съели свежими в полной антисанитарии. Для нас это дикость, для кого-то ― это часть культуры. Да, это источник возникновения новых вирусов. Но в России такого нет, и мы не можем повлиять на то, что происходит в Китае. Как будут китайцы эту проблему решать ― неизвестно. Например, в США есть другая проблема ― свиные сельскохозяйственные ярмарки, где люди тесно контактируют со свиньями, и у них есть свои риски, но это часть культуры. И за этим пристально следят.

дамба.jpg

Будет иллюзией думать, что если закрыть рынки, то передачи вирусов от животных людям не будет. Если вы смотрели фильм Contagion («Заражение»), то, возможно, знаете, что в его основу легла история о вполне реальном прототипе ― вирусе Нипах (Nipah). Смертность от него ― 70 %. Источник ― выделения летучих мышей на фрукты. Как вы будете с этим бороться? Недавно от него семь человек умерло в Бангладеш. Вакцины и лечения нет. И нам повезло ― он не очень эффективно передается от человека к человеку. 

Огромное количество вирусов все время пересекают межвидовые барьеры, и это может не приводить ни к каким последствиям. Я люблю пример про межцарственные переносы ― например, когда вирус есть у растения и вдруг мы находим его в клетках человека. Вирусов ― триллионы, и это часть реальности. Морские водоросли поражаются вирусами растений, которые плавают в воде, и то же самое происходит среди нас. Вы можете быть здоровы клинически, но в вашем мазке, капле крови и другом биоматериале может быть огромное количество вирусов, о которых вы даже не подозреваете...



0 комментариев
Новое
Показать еще
Обсуждения